Il bioprinting è la stampa di cellule e tessuti viventi. È una tecnica promettente che, si spera, un giorno possa risolvere la carenza di donatori di organi coltivando organi dalle cellule stesse dei pazienti. Tuttavia, la stampa di tessuti e cellule viventi è estremamente complicata e devono essere superati molti ostacoli per poterci arrivare. In questo articolo, vengono evidenziate tre soluzioni di bioprinting volumetrico sviluppate di recente da UMC Utrecht che contribuiranno a rendere il bioprinting più rilevante dal punto di vista clinico.
Aumento del bioprinting volumetrico
La prima associazione con la biostampa 3D è la stampa 3D “classica” o la st ampa per estrusione con filamento di plastica. Questo è diventato popolare negli ultimi 15 anni circa, poiché le stampanti a basso costo sono diventate ampiamente disponibili. In linea di principio, dovrebbe essere possibile sostituire la plastica e stampare pezzi di tessuto biologicamente funzionale, con diversi tipi di cellule presenti. Ma per raggiungere questo obiettivo, dovranno essere realizzati tessuti altamente dettagliati e differenziati: anche un millimetro cubo di tessuto di organi avrà bisogno anche di capillari sanguigni, quindi l’asticella è molto alta per le stampanti se vogliamo creare tessuto funzionale che noi può impiantare su una scala clinicamente rilevante.
Con lo sviluppo dei bioink, è diventato possibile il bioprinting per estrusione 3D. Nuovi ugelli, inchiostri nutrienti e impalcature prefabbricate rendono più facile per le cellule sopravvivere a questo processo. E utilizzando vari inchiostri contemporaneamente, diversi tipi di cellule potrebbero essere depositati e così facendo creare tessuti. Tuttavia, la stampa strato per strato richiede ancora molto tempo; molte ore per un oggetto multi-centimetro cubo. È probabile che le cellule muoiano durante questo processo. Inoltre, le stampe per estrusione devono essere in grado di resistere alla gravità, quindi gli inchiostri devono essere robusti, il che significa che non sono molto compatibili con le celle.
Per superare questo processo lento e dipendente dalla gravità, la stampa volumetrica è stata adottata anche per il bioprinting. In questo processo, una fiala rotante con uno speciale gel viene esposta alla luce laser. Dove colpisce la luce laser, il gel fotosensibile si solidificherà rapidamente. Ciò significa che con una ricostruzione della luce laser 3D, è possibile creare forme complesse di più centimetri cubi in pochi secondi. Ora, mentre questo risolve il problema della velocità e della gravità, ha i suoi svantaggi. Questi gel fotosensibili possono, in questo modo, contenere solo cellule in sospensione, quindi controllare quale tipo di cellula finisce dove – e quante di esse – è difficile da controllare. E poiché il gel è duro, è difficile per le cellule muoversi, estendersi e comunicare tra loro, il che è essenziale per la formazione o anche per il funzionamento del tessuto.
Al Centro di medicina rigenerativa di Utrecht, i ricercatori lavorano continuamente per superare queste sfide e i tre documenti discussi di seguito hanno ciascuno risolto parte delle sfide sopra descritte.
Creazione di regioni biologicamente funzionali in una stampa
La biostampa volumetrica, con la quale è possibile stampare in pochi secondi un oggetto di pochi centimetri, offre molte possibilità per la stampa di cellule. La velocità del processo unita alla compatibilità cellulare del gel sono grandi vantaggi. Tuttavia, quando la stampa è terminata, le cellule potrebbero non essere posizionate esattamente dove sono necessarie, né è possibile alterare molto il gel per aiutare lo sviluppo, la crescita o la specializzazione delle cellule per creare tessuti funzionali. Superare questo ostacolo, quindi, è importante, perché nel nostro corpo le cellule sanno dove andare e dove stare seguendo i segnali che percepiscono in specifiche regioni o tessuti.
Aggiunta di funzionalità al gel stampato
Per rendere possibile apportare modifiche chimiche alla stampa dopo il processo di stampa iniziale, i ricercatori hanno giocato con la porosità del gel, nonché con i composti in esso contenuti che si legano con altre molecole nel gel. «Con questa tecnica, è possibile innestare biomolecole nei nostri costrutti stampati in pochi minuti con un’elevata risoluzione spaziale», spiega il primo autore Marc Falandt. “Prima abbiamo stampato i nostri costrutti a base di gelatina con la stampante volumetrica, quindi infondendo questi costrutti con biomolecole e bfotoiniziatore, abbiamo potuto creare complessi motivi 3D all’interno delle strutture di gelatina. Questo metodo ci dà il controllo tridimensionale della posizione in cui vuoi che le tue biomolecole siano intrappolate. Qualcosa che prima non era possibile”.
Aiutare le cellule a trovare la loro strada fornendo loro una mappa chimica
Con questa innovazione, è ora possibile creare stampe volumetriche che possono avere fattori di crescita o proteine bioattive “dipinte” in esse in qualsiasi forma 3D desiderata. Ad esempio, le molecole segnale che guidano la direzione e la formazione dei vasi sanguigni possono essere posizionate in modo tale da creare una scia che attiri nuovi vasi solo dove e quando necessario all’interno dell’oggetto stampato in 3D.
Questi segnali potrebbero quindi attrarre le cellule giuste o aiutare le cellule staminali a realizzare il loro potenziale rigenerativo. Falandt: “Questo lavoro fa davvero i primi passi nello sviluppo e nella caratterizzazione di materiali intelligenti che consentono l’editing biochimico in 3D. In combinazione con la tecnica di bioprinting volumetrico veloce, questo approccio è estremamente promettente per la creazione di scaffold biofabbricati che potrebbero guidare il comportamento e lo sviluppo delle cellule. Potrebbe permetterci di imitare da vicino il complesso ambiente biochimico dei tessuti e degli organi nativi con le nostre biostampe 3D”.
Gel granulari per cellule stampate
Per un tessuto fabbricato con successo, le cellule stampate devono essere coccolate per sopravvivere e prosperare nel prodotto finito. E se devono formare un tessuto funzionale, devono essere in grado di crescere, muoversi e comunicare tra loro.
Sono state provate varie strategie di stampa per risolvere questo problema e tutte hanno i loro pro e contro. Nella stampa per estrusione 3D, le cellule possono essere depositate in una varietà di tipi e con numeri elevati, ma questo processo richiede molto tempo, causa stress meccanico alle cellule ed è dipendente dalla gravità, il che è dannoso per la sopravvivenza e il funzionamento delle cellule. Con la bioprinting volumetrica veloce, la velocità e la gravità potrebbero essere state risolte, ma qui la sfida è che le cellule sono distribuite in modo casuale nella resina e in numero inferiore, e poiché la stampa finale è costituita da resina solida, le cellule non sono in grado di funzionare e comunicare correttamente.
Creare un micromondo granulare
Per risolvere questo problema, i materiali utilizzati per il bioprinting devono fornire un ambiente che consenta l’auto-organizzazione e la comunicazione delle cellule. Sebbene ciò sia generalmente possibile con idrogel morbidi, garantire un’elevata risoluzione di stampa e fedeltà della forma di questi materiali rimane un collo di bottiglia chiave, soprattutto quando si utilizzano tecniche di fabbricazione strato per strato convenzionali.
Il primo autore Davide Ribezzi ha esplorato l’uso delle resine granulari per superare queste sfide. “I gel granulari sono fondamentalmente microparticelle di gel imballate strettamente insieme”, ha detto Ribezzi. “Sebbene ogni microparticella possieda proprietà paragonabili alla sua controparte di idrogel sfuso, le particelle di microgel imballate possono essere progettate e personalizzate per mostrare un’ampia gamma di proprietà utili aggiuntive”. Fare leva sui biomateriali particolati è quindi una strategia promettente per affrontare gli inconvenienti legati all’incapsulamento di cellule di massa e alla processabilità del materiale nei processi di stampa.
Combinazione di diverse strategie di stampa
Le resine granulate hanno infatti permesso ai ricercatori di combinare estrusione e stampa volumetrica. Utilizzando la stampa per estrusione, alcune cellule o altri prodotti chimici possono essere depositati in modo specifico nella resina. Questo approccio ottimizza l’equilibrio tra la velocità della stampa volumetrica e l’accuratezza della stampa per estrusione. Il gel si muove attorno all’ugello di stampa come una crema pasticcera attorno a un dito invadente, quindi le celle possono essere posizionate rapidamente in più strati, senza doversi preoccupare della resistenza della struttura. Quindi, la stampa volumetrica può completare il processo creando e rifinendo le forme attorno alle celle estruse.
Questo processo non è stato privo di sfide. Ribezzi: “La lavorazione dei materiali biologici richiede sempre molta attenzione e una meticolosa pianificazione degli esperimenti. Ma nella nostra ricerca sfruttiamo le proprietà termiche del microgel, che consente una messa a punto precisa delle proprietà meccaniche e ottiche. Ciò si è tradotto in stimoli sintonizzabili percepiti dalle cellule incorporate. Tuttavia, questo più alto grado di messa a punto richiedeva un grado ancora più elevato di attenzione e precisione durante il processo di stampa”.
Più attività biologica
Gli esperimenti con le celle confermano che le resine granulate consentono un’attività biologica molto maggiore dopo la stampa, superando di gran lunga le prestazioni dei gel solidi. Entro otto giorni dalla stampa nella resina, le cellule staminali sono state in grado di diffondersi di più, le cellule endoteliali hanno creato più giunzioni e le cellule simili a neuroni hanno stabilito più connessioni tra loro.
Ribezzi ha inoltre commentato: “Per studi futuri, prevediamo la miscelazione e persino la modellazione locale di microgel ottenuti da materiali diversi. Ci consentirebbe di creare costrutti compositi con proprietà uniche o con sacche bioattive che rilasciano, ad esempio, farmaci. Questi strumenti aumenteranno la funzionalità dei tessuti e apriranno ulteriori opportunità per l’ingegneria dei tessuti, la medicina rigenerativa e l’area emergente dei materiali viventi ingegnerizzati”.
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Tecniche di bioprinting per vasi sanguigni funzionali
Il bioprinting volumetrico è una tecnica veloce, che consente alle cellule di sopravvivere al processo di stampa. Tuttavia, poiché questo tipo di stampa viene eseguito in gel compatibili con le cellule, le stampe risultanti non sono strutturalmente molto solide. Questo è un problema per i vasi sanguigni stampati, che devono essere in grado di resistere a pressioni e flessioni elevate. Per questo motivo è stata perseguita una fusione di bioprinting volumetrico ed elettroscrittura a fusione.
L’elettroscrittura a fusione è un tipo di stampa 3D estremamente accurato che funziona dirigendo uno stretto filamento di plastica fusa (biodegradabile). È in grado di produrre impalcature complesse che sono meccanicamente forti e in grado di gestire la forza. Lo svantaggio qui è che non possono essere stampati direttamente con le celle lì dentro, a causa delle alte temperature coinvolte. Pertanto, qui è stato utilizzato il bioprinting volumetrico per solidificare i gel carichi di cellule sugli scaffold.
Fusione di elettroscrittura e stampa volumetrica
Il processo inizia con la creazione di un’impalcatura tubolare utilizzando l’elettroscrittura a fusione. Questo viene poi immerso in una fiala con gel fotoattivo e posto nel bioprinter volumetrico. In linea di principio, il laser della stampante può solidificare selettivamente il gel che si trova all’interno, sopra e/o intorno allo scaffold. “Per ottenere questo risultato, abbiamo dovuto posizionare l’impalcatura esattamente al centro della fiala”, ha detto il primo autore Gabriël Größbacher. “Qualsiasi deviazione dal centro significherebbe che la stampa volumetrica sarebbe sfalsata. Ma siamo riusciti a centrarlo perfettamente stampando l’impalcatura su un mandrino che abbiamo adattato alla fiala”.
In questo studio, Größbacher e colleghi hanno testato vari spessori dell’impalcatura, ottenendo tubi più o meno resistenti. Infine, hanno anche testato vari posizionamenti dei gel biostampati. Questi potrebbero essere posizionati sul lato interno dell’impalcatura, all’interno dell’impalcatura stessa o all’esterno di essa. Utilizzando due cellule staminali etichettate in modo diverso, il team è stato in grado di stampare una prova di principio del vaso sanguigno con due strati di cellule staminali e cellule epiteliali seminate al centro per coprire il lume del vaso.
Dai tubi ai vasi funzionali
Il design potrebbe anche consentire fori sul lato della stampa, dando la possibilità di una permeabilità controllata del vaso affinché il sangue svolga la sua funzione. Infine, i ricercatori hanno anche creato strutture più complesse come vasi biforcuti e persino vasi con valvole venose funzionali al mantenimento di un flusso unidirezionale.
Größbacher: “Questa è stata una dimostrazione di principio. Quello che ora dobbiamo fare è sostituire le cellule staminali con cellule funzionali che fanno parte di un vero vaso sanguigno. Ciò significa aggiungere cellule muscolari e tessuto fibroso attorno alle cellule epiteliali. Il nostro obiettivo ora è stampare un vaso sanguigno funzionale”.
Sebbene queste innovazioni forniscano opzioni interessanti per portare avanti la bioprinting, funzionerà meglio se possono essere combinate ed espanse. Il leader del gruppo Riccardo Levato ha dichiarato: “Essere in grado di stampare molecole biologicamente attive in una stampa che utilizza gel granulare significa che le cellule possono utilizzare meglio le informazioni molecolari, nonché crescere e svilupparsi in un tessuto, insieme alle cellule vicine”.
