Ricercatori hanno mostrato il sistema AM con filatura a fusione per impalcature tubulari

Molti tessuti tubulari come i vasi sanguigni e la trachea possono subire difetti a lungo termine a causa di traumi e malattie. Con le attuali limitazioni nell’uso di innesti autologhi, la necessità di un sostituto sintetico è di continuo interesse come possibile alternativa. La fabbricazione di questi organi tubolari viene comunemente eseguita con tecniche come l’elettrofilatura e l’elettrobagnatura allo stato fuso utilizzando un collettore rotazionale. Ora un nuovo metodo chiamato melt-spinning e sviluppato dai ricercatori del MERLN, basato su un sistema AM di estrusione rotante a 4 assi, potrebbe rivelarsi più efficiente.

Gli attuali sistemi di produzione additiva (AM) non implementano comunemente l’uso di un asse di rotazione, il che limita la loro applicazione per la fabbricazione di scaffold tubolari. In un nuovo studio del Department of Complex Tissue Regeneration, MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine, dell’Università di Maastricht e dell’Advanced Polymer Materials Group, University Politehnica di Bucarest, i ricercatori hanno sviluppato un sistema AM basato sull’estrusione a quattro assi simile a quello fuso la modellazione della deposizione (FDM) è stata sviluppata per creare impalcature tubolari cave. Il nuovo processo additivo è stato soprannominato “fusione a fusione”.

Un design a poro rettangolare e uno a diamante sono stati ulteriormente studiati per la caratterizzazione meccanica, rispettivamente come geometria dei pori standard e biomimetica. Le analisi di flessione a tre punti hanno rivelato che il design dei pori del diamante è più resistente al collasso del lume rispetto al design rettangolare. Questi dati hanno dimostrato che modificando il design dei pori dell’impalcatura è possibile ottenere un’ampia gamma di proprietà meccaniche. Inoltre, è possibile ottenere il pieno controllo sulla progettazione e sulla geometria dell’impalcatura con il sistema basato sull’estrusione a 4 assi sviluppato, che non è stato riportato con altre tecniche. Questa flessibilità consente la produzione di scaffold per diverse applicazioni di rigenerazione del tessuto tubolare progettando modelli di deposizione adatti per soddisfare i loro prerequisiti meccanici.

Le tecniche AM, come la modellazione a deposizione fusa (FDM), il bioplotting e altre tecnologie basate sull’estrusione, sono adatte per aumentare l’integrità meccanica di uno scaffold producendo fibre con centinaia di micrometri. Il limite principale nella creazione di una struttura tubolare con le attuali configurazioni basate sull’estrusione sono i disegni e le geometrie che possono essere fabbricati, poiché per queste strutture sporgenti e cave è richiesto un materiale di supporto. Questa limitazione è causata principalmente dal fatto che la maggior parte dei sistemi utilizza un approccio di fabbricazione strato per strato depositando successivamente fibre per formare un riempimento di ogni strato all’interno del contorno dell’oggetto e questo processo viene ripetuto fino all’ottenimento dell’oggetto 3D completo. Questa deposizione si verifica normalmente in un substrato piatto che si sposta rispetto alla testina di stampa nel piano XY e nella direzione Z.

L’implementazione di un quarto asse in filatura a fusione consente la possibilità di creare strutture tubolari più complesse, come descritto anche nel campo degli impianti protesici. Altri gruppi hanno implementato un quarto asse nel loro sistema FDM per applicazioni biomediche, tuttavia spesso senza comunicazione tra l’asse di rotazione e il sistema principale, il che si traduce nella creazione di soli design elicoidali. Inoltre, i ponteggi tubolari generalmente non sono completamente caratterizzati dalle loro proprietà meccaniche e dal comportamento per deformazioni assiali, radiali e flessionali.

Lo scopo di questo studio del MERLN era mostrare una tecnica AM basata sull’estrusione simile all’FDM con un quarto asse di rotazione sincronizzato che consente la fabbricazione di complesse geometrie tubolari. Inoltre, è stato ulteriormente studiato il ruolo della geometria nella progettazione delle impalcature e la sua influenza sulle proprietà meccaniche, come la compressione radiale, la resistenza alla trazione e la flessione a tre punti.

Flessione dei muscoli rotatori

In uno studio di follow-up, i ricercatori del MERLN hanno utilizzato la stessa tecnologia di filatura a fusione per fabbricare un innesto vascolare mimetico con parametri di fibra personalizzabili. La filatura per fusione consente la possibilità di creare fibre sottili attorno a un mandrino senza la necessità di un campo elettrico fondendo un polimero e depositandolo direttamente su un mandrino di filatura. Le fibre risultanti sono altamente allineate e riproducibili con piccole variazioni nelle dimensioni delle fibre. I recenti progressi nella tecnica hanno portato alla fabbricazione di fibre core-shell con proprietà meccaniche migliorate.

Senza la necessità di un campo elettrico, i parametri controllabili e incontrollabili del processo di produzione non sono più una limitazione. Di conseguenza, potrebbe essere riassunto in equazioni semplificate per prevedere i parametri delle fibre in termini di dimensioni delle fibre, angolo delle fibre e spaziatura risultante. Ciò potrebbe comportare uno strato barriera più riproducibile. Proprio come SES, queste microfibre richiedono un supporto meccanico. Un sistema basato sull’estrusione a fusione a quattro assi potrebbe fornire questo supporto creando macrofibre più grandi attorno alle microfibre più piccole.

Lo scopo di questo secondo studio MERLN era sviluppare ulteriormente la tecnica di filatura che è in grado di allineare le cellule muscolari lisce in un innesto vascolare di piccolo diametro. Inoltre, sono state formulate equazioni matematiche semplificate, basate sui risultati ottenuti, per prevedere il diametro della fibra, la distanza tra le fibre e l’angolo di deposizione. Le cellule muscolari lisce primarie sono state coltivate sugli scaffold per valutare se le cellule avrebbero imitato morfologicamente la tunica media di un’arteria. Infine, è stata eseguita una co-coltura con cellule endoteliali per valutare se le cellule muscolari lisce primarie allineate influenzassero la morfologia delle cellule endoteliali.

L’allineamento delle cellule muscolari lisce è stato monitorato sugli scaffold fabbricati. Infine, è stata eseguita una co-coltura di cellule muscolari lisce a diretto contatto con cellule endoteliali per valutare l’influenza dell’allineamento delle cellule muscolari lisce sulla morfologia delle cellule endoteliali. I risultati mostrano che le equazioni sono state in grado di prevedere con precisione il diametro, la distanza e l’angolo della fibra. Cellule muscolari lisce vascolari primarie allineate secondo la direzione della fibra che imita l’orientamento nativo. La co-coltura con cellule endoteliali ha mostrato che le cellule muscolari lisce allineate non hanno avuto un’influenza sulla morfologia delle cellule endoteliali. In conclusione, abbiamo formulato una serie di equazioni in grado di prevedere i parametri della fibra durante la filatura a fusione.

Melt-spinning per forza

In un altro studio pubblicato, i ricercatori del MERLN mostrano l’ulteriore ottimizzazione degli innesti vascolari descrivendo la fabbricazione di scaffold tubolari con diversi allineamenti delle fibre, che hanno robuste proprietà meccaniche e sono privi di perdite e suturabili. Gli scienziati hanno anche studiato l’effetto di queste proprietà sul comportamento cellulare delle hMSC differenziate verso cellule simili a SMC. Sono state inoltre seminate cellule endoteliali per ottenere un costrutto comprendente gli strati intima e media dell’arteria.

Il metodo di fabbricazione con filatura a fusione di MERLN ha consentito un controllo preciso sull’orientamento delle fibre nella direzione circonferenziale (come mostrato nella figura sopra). L’angolo tra le fibre è stato quantificato dalle immagini ottenute da SEM. Quando la testina di stampa è stata spostata a una velocità di 1 mm/s, le fibre sono state depositate parallelamente l’una all’altra (angolo 0). Ad una velocità di 10 mm/s, l’angolo tra due fibre era di 10,4 ± 1,0°; ad una velocità di 20 mm/s, l’angolo della fibra era di 19,3 ± 2,5°; e ad una velocità di 30 mm/s, l’angolo della fibra era di 33,6 ± 5,8°. Il diametro della fibra era di 31,6 ± 3,9 μm e non era influenzato dalla velocità della testina di stampa. Il diametro della fibra può anche essere modificato modificando la velocità di rotazione del collettore. In questo studio MERLN finale, questo parametro è stato mantenuto costante a 1060 rpm. Per ulteriori test, sono stati scelti tre allineamenti delle fibre (0, 19 e 33°).

È stata eseguita una prova di flessione su tre punti per valutare il comportamento meccanico dei ponteggi prodotti (vedi figura a sinistra). I ponteggi di 1° hanno mostrato un comportamento fragile perché si sono rotti già al 10% di deformazione. Gli scaffold a 20° erano più robusti, non mostravano difetti visibili fino al 60% di deformazione, ma successivamente hanno iniziato a presentare chiare aperture delle fibre. Gli scaffold a 30° non presentavano difetti visibili alla massima deformazione testata del 160%. Le impalcature a 20 e 30° possono essere piegate fino al 160% di deformazione (massimo testato) senza attorcigliamenti o rotture dell’impalcatura.

Per testare la capacità degli scaffold di trattenere i liquidi, sono stati introdotti tappi spinati Luer lock a ciascuna estremità degli scaffold e collegati a una siringa montata su una pompa a siringa (mostrata nella figura seguente). Acqua con colorante alimentare blu o una soluzione al 5% di BSA in PBS con colorante rosso scorreva attraverso le impalcature. La soluzione con BSA è stata utilizzata come “proxy” del sangue. Non è stata osservata alcuna perdita a nessuna delle velocità di flusso testate (1,2, 10,2 e 25 mL/min). Nonostante le impalcature fossero in grado di trattenere il liquido, presentavano un’elevata porosità (Figura supplementare 3). È interessante notare che gli scaffold testati negli esperimenti di tenuta erano stati precedentemente utilizzati per il test di flessione a tre punti, indicando che le elevate sollecitazioni applicate non avevano influenzato negativamente gli scaffold.