Lo stato del bioprinting

Ci occupiamo di bioprinting 3D da quasi un decennio, a partire da quando l’industria del bioprinting ha iniziato ad espandersi oltre i sistemi di fascia alta utilizzati esclusivamente per la ricerca accademica in un giovane segmento commerciale. Nel tempo si è riempito di hardware nuovo e più accessibile, materiali commerciali e sempre più standardizzati e il sogno delle prime applicazioni commerciali. Oggi tutti questi aspetti dell’industria della biostampa stanno vivendo una crescita vivace, spingendo l’innovazione su tutti e tre i fronti e consentendo l’emergere di una vera e propria industria.

Nel 2013 abbiamo avuto l’opportunità unica di frequentare uno dei primi corsi estivi sulla bioprinting, tenuto dal Professor Jos Malda all’Università di Utrecht. Insieme ad altri hub chiave (il Wyss Institute di Harvard a Boston, la POSTECH University di Pohang, in Corea e altri), i ricercatori di Utrecht sono stati in prima linea nell’innovazione e nella democratizzazione della biostampa. A quel tempo, il professor Malda ci ha permesso di acquisire una comprensione più profonda delle possibilità a portata di mano. Nel febbraio 2022, lo stesso gruppo ha presentato i primi esempi in assoluto di bioprinting di unità di tessuto epatico funzionale (fegato) utilizzando la tecnologia di bioprinting volumetrico, che sembra essere una delle direzioni più praticabili per la rigenerazione e infine la bioingegneria di organi e tessuti complessi. Di recente, una nuova società,Trestle Biotherapeutics , è emersa per commercializzare innesti di tessuto renale (rene) sulla base di ricerche condotte negli ultimi dieci anni dalla professoressa Jennifer Lewis Lab presso il Wyss Institute di Harvard. Anche 3D Systems, uno dei leader nel settore della manifattura additiva convenzionale, è entrata nel mercato lavorando su hardware per bioprinting  con l’acquisizione di Allevi), bioink (collaborazione collPlant) e applicazioni (principalmente tessuto polmonare, con United Therapeutics).

I tessuti del fegato e dei reni sono visti come i tessuti più complessi e più utili che potrebbero essere ottenuti con la bioprinting entro un lasso di tempo accettabile. I loro usi sono sia nell’innesto di tessuto per la medicina rigenerativa che nei test di sviluppo di farmaci (DDT). Tuttavia, la strada per lo sviluppo di questi tessuti biostampati è stata difficile e ha già avuto vittime. Organovo, l’azienda che ha creato quasi da sola l’idea della bioprinting commerciale basata sul bioprinting del tessuto renale ed epatico, non è stata in grado di portare i suoi prodotti sul mercato e ha bruciato diversi milioni di dollari prima di abbandonare il segmento del bioprinting.

Il bioprinting promette di rivoluzionare il modo in cui ci avviciniamo alla medicina e all’ingegneria tissutale. Ha il potenziale per affrontare la carenza globale di donatori di organi e trasformare l’industria medica, offrendo soluzioni per numerose malattie e lesioni. In questo articolo completo, esploreremo tutto ciò che è necessario sapere sul bioprinting, dai diversi tipi di bioprinter e bioink alle varie applicazioni di questa tecnologia all’avanguardia. Che tu sia uno studente, un ricercatore o semplicemente curioso di questo entusiasmante campo, questo articolo fornirà una panoramica completa del bioprinting, del suo stato attuale e del suo potenziale futuro.

Cosa intendiamo per bioprinting?

Il termine bioprinting 3D (o semplicemente bioprinting) si riferisce a una famiglia di metodi di produzione additiva e digitale che producono oggetti fisici strato dopo strato, utilizzando una macchina (una biostampante 3D). Come la stampa 3D convenzionale, il bioprinting crea oggetti basati su modelli 3D progettati nel software CAD. Gli oggetti (o costrutti) biostampati sono solitamente repliche di tessuti umani o animali, creati attraverso la combinazione di cellule con altri biomateriali e materiali biocompatibili come polimeri e ceramiche.

I processi di bioprinting, come i processi AM industriali, possono essere classificati in due categorie principali: basati su strumenti o indiretti (stampa basata su scaffold) e diretti (stampa senza scaffold). Entrambi sono ulteriormente suddivisi in due categorie: bioprinting assistito da laser e bioprinting senza laser, ognuna delle quali comprende diverse sottocategorie.

I costrutti biostampati sono intrinsecamente multimateriali e, in una certa misura, continuano ad evolversi dopo essere stati stampati, il che è un notevole contrasto con la stampa 3D per la produzione industriale. Diversi tipi di cellule, varie impalcature e materiali per impalcature, vascolarizzazione (la necessità di fornire ossigeno alle cellule attraverso e sotto la superficie del costrutto) e numerosi materiali della matrice extracellulare possono tutti far parte di strutture biostampate funzionali. Man mano che le cellule si sviluppano e si adattano, c’è anche un fattore tempo da considerare. Questo è anche il motivo per cui alcuni si riferiscono al bioprinting avanzato come a un tipo di stampa 4D.

Applicazioni del bioprinting

Alcuni tipi di produzione additiva industriale sono già passati dalla ricerca e dal prototipo alle applicazioni commerciali per l’uso finale. Sebbene si preveda che la bioprinting 3D segua una traiettoria simile, praticamente tutto il potenziale commerciale esistente per l’hardware di bioprinting è attualmente focalizzato sulle applicazioni di ricerca. Il cambiamento significativo è che, sebbene questa ricerca fosse stata limitata alle istituzioni accademiche, alcune ricerche stanno ora iniziando a essere condotte nel settore aziendale. Le più grandi aziende farmaceutiche sono ancora riluttanti ad abbracciarlo, ma hanno iniziato a esaminarlo.

L’obiettivo finale potrebbe essere quello di replicare organi funzionanti utilizzando tecnologie di bioprinting, ma la riproduzione di organi complessi tramite bioprinting richiederà progressi ben oltre le capacità della tecnologia e dei materiali esistenti. Per il prossimo futuro, le applicazioni rilevanti del bioprinting saranno per i test di sviluppo di farmaci e, in una certa misura, per i prodotti alimentari (agricoltura cellulare). In termini di medicina rigenerativa, potremmo iniziare a vedere una certa adozione del bioprinting per innesti di tessuto e alcuni impianti basati su polimeri e ceramiche biocompatibili e bioriassorbibili non cellulari.

La multimaterialità, che è ancora uno dei maggiori limiti di tutti i metodi di stampa 3D industriale, è una barriera ancora maggiore nella stampa di tessuti e organi, poiché gli organi più complicati del corpo sono costituiti da molti tipi di cellule diverse. La necessità di approcci più volumetrici (stampa “olograficamente” da tutti i lati contemporaneamente) e la velocità di produzione sono tra i limiti più evidenti delle attuali tecnologie, sebbene esistano strutture biologiche “più semplici” che potrebbero essere biostampate, anche per l’impianto in umani, entro questo decennio.

La produzione di tessuto renale ed epatico è limitata alle applicazioni di ricerca, in cui i tessuti stampati in 3D offrono alcuni vantaggi rispetto ai tessuti stampati in 2D, ma i veri organi funzionali sono ancora molto lontani. La rigenerazione cardiaca (valvole cardiache riassorbibili stampate in 3D, ad esempio) e, più recentemente, la rigenerazione polmonare hanno fatto progressi. Uno dei fattori chiave del bioprinting per le applicazioni di medicina rigenerativa è, ovviamente, l’enorme necessità di organi per il trapianto.

Studi sulla biostampa

Quasi tutte le cellule del corpo vivono in una matrice extracellulare (ECM) e comunicano tra loro tramite segnali biochimici e meccanici. Le interazioni tra le cellule e tra le cellule e la MEC formano una rete di comunicazione che mantiene la specificità e l’omeostasi del tessuto. Nei test di coltura cellulare 2D, l’incapacità delle cellule di acquisire organizzazione strutturale e connettività in vitro potrebbe limitare o compromettere attributi come morfologia cellulare, vitalità, proliferazione, differenziazione, espressione genica, risposta agli stimoli, metabolismo dei farmaci e funzione cellulare complessiva. I test preclinici di screening di farmaci e tossicità basati su cellule hanno un potere predittivo debole a causa di questi vincoli. Le prove suggeriscono che le colture cellulari 3D possono imitare meglio la specificità del tessuto nativo con rilevanza fisiologica rispetto alle colture 2D.

Ciò è particolarmente visibile nella differenziazione e coltura delle cellule staminali, nella biologia del cancro, nello screening dei farmaci e della tossicità e nell’ingegneria dei tessuti. La coltura di aggregati cellulari in sospensione senza l’uso di substrati basati su matrici è stata utilizzata in alcuni dei modelli 3D più basilari. Per anticipare con precisione lo sviluppo dei tessuti e la morfogenesi, i modelli 3D in vitro devono imitare elementi del comportamento delle cellule in vitro. Scaffold con caratteristiche fisiche e biologiche variabili sono stati sviluppati utilizzando una varietà di materiali e tecniche di costruzione per soddisfare le esigenze di vari tipi di cellule. Per le applicazioni in vitro della crescita cellulare 3D, gli idrogel a base di ECM prodotti naturalmente (collageni, elastina, fibronectine e laminine) sono l’approccio più comunemente impiegato.

Aziende in bioprinting

A causa del suo potenziale valore commerciale in ampi campi come la scoperta farmaceutica (test di tossicità dei farmaci), la medicina personalizzata, il trapianto di tessuti e altri segmenti commerciali come i test sui cosmetici e le alternative ai prodotti alimentari di origine animale, la biostampa 3D si è trasformata da un’attività puramente sperimentale e segmento di ricerca a un settore emergente, accelerando in modo significativo negli ultimi cinque anni (poiché le tecnologie di stampa 3D, in generale, sono diventate molto più ampiamente disponibili).

Secondo l’indice di 3dpbm, attualmente ci sono almeno 135 aziende che lavorano nel mercato globale della bioprinting (senza includere i rivenditori di prodotti bioprinting). Tra queste aziende, il 38% sono produttori di bioprinter, il 30% sono fornitori di biomateriali e il 44% sono laboratori o fornitori di servizi di bioprinting. Si noti che le aziende possono appartenere a più categorie e che i numeri continuano ad aumentare man mano che nuove aziende emergono e/o vengono scoperte dal team di ricerca di 3dpbm.

Nell’area dell’hardware per bioprinter, un’azienda, BICO (precedentemente Cellink) , ha svolto un ruolo importante nel guidare l’espansione del settore. L’azienda ha iniziato producendo e distribuendo bioink e poi ha continuato a costruire una linea di biostampanti per estrusione a basso costo. Dopo aver introdotto i suoi primi prodotti commerciali, Cellink è cresciuta a un ritmo vertiginoso, creando una comunità di appassionati di bioprinting, ricercatori e professionisti in varie università in tutto il mondo. In pochi anni la società viene quotata al NASDAQ svedese e apre una filiale nel mercato statunitense. Da allora molte aziende sono entrate a far parte della famiglia BICO e della sua missione di bio-convergenza dal 2016, con Advanced Biomatrix (biomateriali) e Nanoscribe (hardware di stampa nano 3D 2PP) tra i più notevoli. L’azienda ha ora 14 aziende che offrono a ricercatori e medici tecnologie, prodotti e servizi per aiutarli a generare, comprendere e padroneggiare la biologia, con particolare attenzione alla stampa 3D ma con un’ampia gamma di applicazioni.

Molte altre aziende hanno sviluppato attività significative basate sull’hardware di bioprinting in passato e molte altre lo stanno facendo attualmente, tra cui Cellink. Alcuni dei produttori di sistemi più noti e di lunga data includono RegenHU, un’azienda svizzera che è stata tra le prime a commercializzare sistemi hardware di bioprinting di fascia alta. Un altro operatore tradizionale chiave nel mercato dell’hardware è EnvisionTEC, uno dei principali produttori di sistemi DLP industriali che è stato recentemente acquisito da Desktop Metal e rinominato ETEC/Desktop Health. Il bioplotter di ETEC è stato utilizzato per dozzine di studi pubblicati. Altri nomi rilevanti includono Advanced Solutions, la società che ha sviluppato un robot di bioprinting multiasse (il BioAssembly Bot) e il relativo software e ha stretto una partnership di distribuzione con GE Healthcare. Regenovo è il nome leader per la produzione di bioprinter in Cina, con diverse macchine sul mercato. Le aziende che promuovono soluzioni a basso costo che prendono di mira l’hardware come core business includono Rokit e Allevi, la società che è stata recentemente acquisita da 3D Systems, oltre a una serie di altri.

In questo contesto, il rinnovato interesse che 3D Systems, uno dei pionieri e leader di lunga data del mercato della produzione additiva, ha manifestato può offrire una delle indicazioni più chiare che una solida industria della bioprinting e le relative opportunità di mercato sono ora a portata di mano. L’azienda ha preso di mira i polmoni come applicazione chiave per la bioprinting degli organi attraverso una partnership con United Therapeutics e sta collaborando con CollPlant su scaffold tissutali per la ricostruzione del seno. Ha inoltre acquisito Allevi per costruire la sua attività commerciale di hardware per bioprinting e ha nominato l’ex Chief Scientific Officer di Allevi Taci Pereira General Manager of Bioprinting. Nel settembre 2022, 3D Systems ha creato una nuova consociata interamente controllata, Systemic Bio, dedicata alla bioprinting per la scoperta e lo sviluppo di farmaci, e ha nominato Taci Pereira CEO di tale attività.

Alcune aziende che sviluppano tecnologie hardware di bioprinting, come TandR Biofab, 3Dbio, Poietis e altre, si stanno concentrando su specifiche applicazioni di bioprinting 3D, come tessuti e innesti impiantabili. Ad esempio, la società sudcoreana T&R Biofab non solo ha aperto la strada alla propria tecnologia di bioprinting, ma sta anche sviluppando una vasta gamma di applicazioni per la sua piattaforma. T&R Biofab, che sta per Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Biofabrication , è alla base di alcuni progetti davvero innovativi.

Materiali per la biostampa

Combinazioni di polimeri, ceramiche, cellule, aggregati cellulari, fattori di crescita, idrogel, componenti di scaffold e altri materiali costituiscono gli inchiostri per biostampa o bioinchiostri. Per garantire la vitalità cellulare (cioè che le cellule sopravvivano al processo di stampa), i bioinchiostri cellulari devono essere elaborati con cautela. I bioink sono disponibili in una gamma ampia e in rapida espansione di materiali diversi, con molte istituzioni e aziende che producono materiali internamente per soddisfare le proprie esigenze specifiche. Più bioink commerciali vengono introdotti nel mercato globale man mano che l’industria si evolve e i criteri diventano più standardizzati. Qui puoi trovare una panoramica di alcune aziende e materiali bioink chiave.

I biomateriali, progettati per l’uso nella biostampa, includono un’ampia gamma di materiali idrogel, metallici, ceramici, polimerici, compositi e cellulari. Il miglior metodo di stampa è determinato dalle proprietà fisiche dei materiali. I materiali a bassa viscosità, ad esempio, sono più attraenti per il bioprinting perché le cellule prosperano in un ambiente a bassa pressione. Altri parametri del materiale come la dimensione dei pori e l’interconnettività possono avere un impatto sulle celle incapsulate.

In generale, tutti i materiali di consumo utilizzati nelle bioprinter per applicazioni di bioprinting sono indicati come bioink. I bioink sono talvolta usati come materiali che contengono cellule specifiche, distinguendoli dagli idrogel puri e dai materiali per impalcature. I bioink sono tipicamente polimerici, sebbene possano anche essere fatti di ceramica o metalli. I bioink sono ulteriormente classificati come bioink sacrificali, reagenti a base di matrice, GAG ECM a matrice, esaltatori di stampa a matrice e bioink a polimerizzazione UV.

Per accogliere le cellule incapsulate e, in caso di impianto, i tessuti del ricevente, i materiali dell’impalcatura devono essere biocompatibili. L’impianto deve essere citocompatibile, consentendo alle cellule di crescere, aderire, proliferare e migrare rimanendo al sicuro per l’ospite e senza causare infiammazioni significative o rigetto immunologico.

Gli scaffold di ingegneria tissutale sono stati realizzati con quasi tutti i materiali di stampa 3D privi di cellule, inclusi metalli, polimeri sintetici e naturali. Per migliorare la resistenza meccanica dei sostituti per la riparazione dei tessuti duri, le polveri di metallo e idrossiapatite vengono generalmente impiegate come materiali di partenza.

Idrogel

Gli idrogel sono uno strumento importante per far crescere e mantenere le cellule con successo perché consentono alle cellule di crescere e interagire con tutto l’ambiente circostante in un ambiente 3D. Le cellule cresciute in modelli 3D hanno dimostrato di essere più rilevanti dal punto di vista fisiologico, con una migliore vitalità cellulare, morfologia, proliferazione e differenziazione. Poiché sono costituiti da grandi reti tridimensionali di catene polimeriche che trattengono una grande quantità di acqua, gli idrogel sono materiali ideali per la biostampa. A causa della loro vicinanza all’ambiente tissutale originale, i polimeri naturali sono comunemente usati negli idrogel come materiali stampabili che racchiudono e stampano cellule viventi. Alginato, collagene, gelatina, gelMA, fibrina e acido ialuronico sono materiali comuni di idrogel.

L’alginato è un polisaccaride derivato dalle alghe (una molecola di carboidrati polimerici). È formato da due monosaccaridi che si ripetono. L’alginato reticolato è attraente per la stampa 3D di tessuti/organi grazie alla sua struttura paragonabile all’ECM nativo, alla grande biocompatibilità e alla facilità di gelificazione rapida. È inoltre adattabile a un’ampia gamma di applicazioni di ingegneria tissutale. I residui di glicina, prolina e idrossiprolina sono abbondanti nel collagene. Il collagene è la proteina più diffusa nella matrice extracellulare di molti tessuti (ECM). Crea un idrogel in circostanze fisiologiche formando una tripla elica. A causa della presenza di RGD cellulare interattivo (Arginina-Glicina-Acido aspartico), che stimola l’adesione cellulare, il collagene è anche considerato un buon materiale per l’incapsulamento cellulare.

Il collagene denaturato è anche usato per fare la gelatina. Questa sostanza è ampiamente utilizzata nell’industria alimentare, farmaceutica e cosmetica come agente gelificante. Fibronectina, vimentina, vitronectina e peptidi RGD sono tutte proteine ​​comuni nella gelatina che inducono l’attaccamento cellulare tramite i recettori dell’integrina.

A causa delle loro caratteristiche biologiche accettabili e delle caratteristiche fisiche personalizzabili, la gelatina metacriloilica (GelMA), gli idrogel sono stati ampiamente sfruttati per numerosi scopi biomedici. A causa dell’inclusione di motivi peptidici sensibili all’attacco cellulare e alla metalloproteinasi di matrice, gli idrogel GelMA rispecchiano da vicino diverse importanti caratteristiche dell’ECM originale, consentendo alle cellule di proliferare e diffondersi negli scaffold basati su GelMA. GelMA è anche adattabile in termini di lavorazione. Gli idrogel a base di GelMA sono efficaci in una varietà di applicazioni di ingegneria dei tessuti, tra cui ossa, cartilagine e ingegneria dei tessuti cardiaci e vascolari, solo per citarne alcuni. Oltre all’ingegneria dei tessuti, gli idrogel GelMA sono utilizzati nella ricerca cellulare fondamentale, nella segnalazione cellulare, nella consegna di farmaci e geni e nel biorilevamento.

L’acido ialuronico (HA) è un materiale biologico costituito da un componente polisaccaridico lineare dell’ECM. Per le applicazioni di stampa 3D di tessuti/organi, questo materiale presenta elevata biocompatibilità, viscoelasticità, idrofilia e biodegradabilità. La coniugazione chimica di gruppi di metacrilato per generare un gel tramite polimerizzazione con radicali liberi sotto esposizione ai raggi UV è una modifica frequente dell’HA.

Cellule, organoidi e sferoidi

La stampa di tessuti e organi si basa in gran parte sulla stampa cellulare. Le rigide condizioni di stampa, tuttavia, limitano i materiali bioink disponibili. Inoltre, la rigidità del biomateriale, i gruppi funzionali e la forma della superficie hanno un impatto sul comportamento cellulare. Per l’inchiostro biostampato, le cellule sono spesso racchiuse in idrogel biodegradabili che imitano un ambiente simile ai tessuti. Le proprietà degli idrogel possono proteggere le cellule interne dallo stress di taglio creato durante il processo di stampa, consentendo loro di mantenere funzioni biologiche come l’auto-rinnovamento delle cellule staminali e la potenza di differenziazione multi-lignaggio.

I processi di bioprinting possono utilizzare una varietà di tipi di cellule. Le dimensioni e la morfologia della cellula o dell’aggregato cellulare, così come la sua capacità di essere trasmessa attraverso il processo di stampa in forma sana, sono le limitazioni più comuni. La temperatura, le sollecitazioni di taglio, l’accelerazione e la decelerazione dovrebbero essere tutte considerate dal punto di vista della cellula e di altri componenti fragili del bioink.

Gli sferoidi cellulari sono modelli 3D di base che possono essere realizzati da una varietà di tipi di cellule e formano sferoidi a causa del desiderio intrinseco delle cellule aderenti di aggregarsi. Corpi embrionali, mammosfere, sferoidi tumorali, epatosfere e neurosfere sono tutti esempi di sferoidi.

In vitro, le cellule staminali dei tessuti adulti possono generare organoidi 3D auto-organizzanti. Gli organoidi sono strutture 3D auto-organizzanti che crescono in vitro, incorporate in una matrice extracellulare (ECM) e assomigliano al loro organo di origine, simile agli sferoidi evoluti. Possono essere costituiti da una gamma di tessuti e fonti cellulari, inclusi espianti di tessuti primari, linee cellulari, cellule staminali adulte multipotenti, cellule staminali embrionali pluripotenti (cellule ES) e cellule staminali pluripotenti indotte (cellule iPS).

Polimeri bioriassorbibili

Nella biostampa 3D, ci sono alcuni diversi polimeri sintetici che sono ampiamente utilizzati. Il policaprolattone (PCL), il poli(lattico-co-glicolide) (PLGA), il polietilenglicole (PEG) e il polossamero 407 (Pluronic F127) sono solo alcuni di questi. Nel tentativo di aumentare le risposte cellulari, è possibile combinare miscele di polimeri sintetici e naturali

A causa della sua bassa temperatura di fusione (59–64°C) e della facilità di stampa, il PCL è il più ampiamente utilizzato nelle procedure di microestrusione. Il PCL è inoltre atossico, biocompatibile e presenta un profilo di erosione/biodegradazione di massa indotto dall’idrolisi, che consente di preservare la forma della struttura prima della disintegrazione. PCL è un materiale per impalcature di ingegneria tissutale che può essere utilizzato per impalcature di stampa 3D per tessuti e organi 3D come struttura di supporto per garantire la fedeltà della forma nelle costruzioni caricate di cellule stampate.

Alterando il rapporto di polimerizzazione tra PLA e PGA, il PLGA è un termoplastico biocompatibile che consente una degradazione controllata. L’applicazione più comune del PLGA nella bioprinting 3D è come substrato di biocarta su cui le cellule possono essere impilate per costruire strutture tissutali 3D ad alta risoluzione utilizzando tecniche di bioprinting laser. Il PLA autonomo è uno dei materiali più utilizzati nella stampa 3D a basso costo, ma trova impiego anche nella biostampa come termopolimero biodegradabile e biocompatibile.

Il PEG (Polyethylene glycol) è un polimero idrofilo, biocompatibile, approvato dalla FDA con una vasta gamma di usi in biomedicina. Poiché è solubile in acqua, il PEG svolge un ruolo di materiale sacrificale rappresentativo per la produzione di complicate costruzioni 3D. Prima di creare reti fisiche o chimiche con il PEG come bioinchiostro, il polimero deve essere modificato chimicamente. Il PEG modificato chimicamente è comunemente reticolato tramite polimerizzazione indotta da fotoiniziatore (PI) sotto esposizione ai raggi UV, che è un componente fondamentale per la formazione del gel.

Il polossamero 407 è un tensioattivo insolubile in acqua che appartiene alla famiglia dei copolimeri del polossamero. Il polossamero 407 è un copolimero a tre blocchi costituito da un blocco di glicole polipropilenico idrofobo al centro e da due blocchi di glicole polietilenico idrofilo su entrambi i lati. I due blocchi PEG sono lunghi circa 101 unità ripetute, mentre il blocco di glicole propilenico è lungo circa 56 unità ripetute. Pluronic F127 è il nome commerciale della sostanza chimica sviluppata da BASF.

Ceramica

A causa delle loro eccezionali proprietà meccaniche, osteoconduttività e compatibilità con le ossa, le ceramiche come fosfato tricalcico (TCP), HA/idrossiapatite), ZrO2 (zirconia) e SiO2 (silicato) sono comunemente utilizzate nell’ingegneria del tessuto osseo. La ceramica più utilizzata per l’ingegneria del tessuto osseo è l’idrossiapatite (HA, da non confondere con l’acido ialuronico, che è anche HA). L’HA può essere impiegato in una varietà di forme nelle tecnologie di bioprinting 3D, tra cui polvere, liquami e granuli. La fluidità richiesta per le tecniche di stampa 3D può essere ottenuta granulando l’HA o miscelandolo con altre soluzioni polimeriche. Per la coalescenza di particelle di HA in polvere e persino l’inclusione di cellule, una soluzione polimerica viene spesso utilizzata come legante liquido. Poiché l’HA è abbondantemente presente nei denti e nelle ossa umane,

Tecnologie di bioprinting

Il getto di materiale è stato la base per la prima tecnologia di bioprinting. Questo metodo è correlato ai metodi di getto di materiale di stampa 3D come PolyJet di Stratasys o MultiJet Printing di 3D Systems, che sono simili alla tradizionale stampa a getto d’inchiostro 2D. I primi bioprinter erano stampanti a getto d’inchiostro 2D modificate che spruzzavano ingredienti biologici su una piattaforma mobile dell’asse Z per creare strati 3D sovrapposti. Oggi la maggior parte delle biostampanti sul mercato si basa su tecnologie di estrusione, tuttavia i sistemi più sofisticati integrano più processi (laser assistiti e senza laser).

Impalcato e non

Le impalcature forniscono il supporto meccanico e la struttura fisica che consentono alle cellule di aderire, crescere e sostenere le loro capacità fisiologiche. Affinché le cellule aderiscano, proliferino, si differenziano e secernono matrice extracellulare, uno scaffold deve fornire una buona biocompatibilità o citocompatibilità. I composti bioattivi abbondano nell’ECM. I metodi di fabbricazione tradizionali per impalcature tridimensionali, d’altro canto, mancano di un controllo preciso sulle caratteristiche strutturali interne e sulla topologia. D’altra parte, diverse tecnologie di produzione additiva di polimeri, che vanno dall’estrusione di materiali alla stereolitografia e persino alla sinterizzazione laser selettiva, possono essere utilizzate per creare sofisticate impalcature di ingegneria tissutale interfacciale.

Le impalcature, tuttavia, rimangono strumenti per la bioprinting delle costruzioni in modo indiretto. Di conseguenza, hanno limiti geometrici che le tecniche di bioprinting senza scaffold possono superare. Se le cellule viventi vengono stampate direttamente su un substrato, la struttura di supporto può essere generata automaticamente grazie alle attività naturali delle cellule. In tali casi, il bioprinting senza scaffold può essere un’opzione praticabile per la generazione di complicati sistemi vascolari all’interno di costrutti bioprinted.

Bioprinting laser assistito

I processi di bioprinting, come la stampa 3D industriale, possono essere ulteriormente classificati in quelli che utilizzano un laser per avviare una reazione di polimerizzazione (indurimento) e quelli che non lo fanno (e generalmente utilizzano calore o pressione). Questi sono anche conosciuti come LAB (bioprinting laser-aided) e LFB (bioprinting senza laser).

La biostampa assistita da laser diretto impiega una sorgente laser simile a quella utilizzata nella stereolitografia laser (SLA) per dirigere le cellule viventi sotto forma di goccioline su un substrato verso luoghi predeterminati digitalmente. Dopo aver trasferito le cellule dal nastro, il substrato ricevente contiene un biopolimero o un mezzo di coltura cellulare per mantenere l’adesione e la proliferazione cellulare. Il contatto prolungato e diretto della luce laser con le cellule, d’altro canto, determina una sopravvivenza cellulare limitata. LIFT (Laser Induced Forward Transfer) e LGDW (Laser Guided Direct Writing) sono due approcci LAB, tuttavia, la stereolitografia è oggi la tecnologia LAB più significativa per lo sviluppo commerciale. Questo è lo stesso approccio che Charles Hull, il pioniere di 3D Systems, ha inventato nel 1986 e commercializzato poco dopo.

Nel bioprinting, la stereolitografia è suddivisa in varie sottocategorie. La microstereolitografia (MSTL) è una tecnica per la fabbricazione di oggetti 3D a forma libera su scala micrometrica, che utilizza componenti ottici per ridurre il diametro del raggio laser. Un altro metodo è la microstereolitografia basata sulla proiezione (pMSTL), che utilizza la tecnologia di stampa 3D DLP per fabbricare microstrutture. Polimeri, idrogel reattivi, polimeri a memoria di forma e biomateriali sono esempi di materiali utilizzati in questo processo. La polimerizzazione a due fotoni (2PP) è un processo di stampa 3D basato su laser che utilizza l’assorbimento a due fotoni (2PA) e un laser per avviare una reazione chimica che induce la polimerizzazione di un materiale fotosensibile, simile alla stereolitografia ma molto più dettagliata (per scala nanometrica). Viene anche utilizzato per applicazioni di bioprinting. Di tutte le tecniche di stampa 3D, 2PP ha la più alta risoluzione. I ricercatori sono stati in grado di costruire habitat 3D per l’adesione cellulare e la proliferazione utilizzandolo.

Bioprinting volumetrico

La scalabilità delle tradizionali tecnologie di bioprinting e produzione additiva è limitata dalla loro velocità di stampa, poiché i lunghi processi di biofabbricazione compromettono la funzionalità cellulare. Il bioprinting volumetrico supera tali limiti mediante il bioprinting di costrutti di dimensioni anatomiche e di dimensioni clinicamente rilevanti, in un lasso di tempo che va da secondi a decine di secondi.

Nel 2019, un team di ricercatori dell’Utrecht Medical Center e dell’École Polytechnique Fédéral Lausanne (EPFL) ha dimostrato la biostampa di grandi costrutti di tessuti viventi elaborando bioresine a base di idrogel compatibili con le cellule con una stampante laser volumetrica a luce visibile. Gli scienziati hanno sviluppato una biostampante personalizzata appositamente per questo progetto con l’obiettivo di creare una società spin-off dedicata esclusivamente alla commercializzazione di queste applicazioni. Gli autori dello studio includevano pionieri della bioprinting come i professori Jos Malda e Riccardo Levato dell’Utrecht Medical Center.

Mentre tutta l’attuale bioprinting si basa sulla deposizione e l’assemblaggio strato per strato di blocchi di costruzione ripetitivi (tipicamente fibre o voxel di idrogel carichi di cellule, singole cellule o aggregati cellulari), il metodo volumetrico descritto sfrutta una stampa ispirata alla tomografia ottica approccio, basato sulla proiezione della luce visibile, per generare costrutti tissutali carichi di cellule con elevata vitalità da idrogel fotosensibili a base di gelatina. Questo metodo consente la creazione di architetture a forma libera, difficili da riprodurre con la stampa convenzionale. Questi includono modelli di osso trabecolare anatomicamente corretti con germogli angiogenici incorporati e innesti meniscali. Nel 2022, lo stesso gruppo è stato in grado di ottenere una bioprinting volumetrica ultraveloce (<20 secondi) di unità epatiche ingegnerizzate su larga scala (>1 cm3), che sono funzionali e in grado di eseguire processi chiave di eliminazione delle tossine che i fegati naturali svolgono nel nostro corpo. La capacità di biostampare unità funzionali così grandi del fegato aprirà nuove opportunità per la medicina rigenerativa e i test per lo sviluppo di farmaci (DDT).

Bioprinting senza laser

La stampa 3D a getto di materiale (a getto d’inchiostro o MJ) e a estrusione di materiale (MEX) sono due famiglie di tecnologie in Laser Free Bioprinting (LFB) che sono riconducibili ai processi AM industriali. La differenza fondamentale tra queste due tecniche è che nel material jetting la testina di stampa contiene diversi ugelli microscopici, mentre nella stampa 3D per estrusione ogni materiale viene estruso e depositato da un solo ugello (o al massimo due o tre). Le biostampanti a getto di materiale, come le stampanti 3D a getto di materiale per la produzione industriale, si basano su stampanti desktop a getto d’inchiostro. Nelle stampanti a getto d’inchiostro 3D vengono utilizzati orifizi di dimensioni micrometriche e una testina di stampa che può essere azionata da valvole termiche, piezoelettriche o elettromagnetiche. Il bioinchiostro viene forzato attraverso l’apertura che porta alla testina della stampante da un impulso di pressione generato nel serbatoio.

Il bioprinting a getto d’inchiostro, l’espulsione di goccioline acustiche e la micro-valvola sono le tre diverse tecnologie utilizzate nel bioprinting basato su goccioline. Il bioprinting sonico crea goccioline utilizzando onde acustiche. Una pompa a solenoide viene utilizzata per espellere le goccioline nella bioprinting con microvalvola. Il getto d’inchiostro continuo (CIJ), Drop-On-Demand (DoD) ed ElectroHydroDynamic (EHD) sono le tre sottofamiglie della biostampa a getto d’inchiostro. La bioprinting drop-on-demand utilizza attuatori termici o piezoelettrici (o forze elettrostatiche) per generare le goccioline, mentre la bioprinting drop-on-demand no. La bioprinting a getto elettroidrodinamico (EHD), d’altra parte, utilizza elettricità ad alta tensione.

L’estrusione di materiale, nota anche come modellazione a deposizione fusa (FDM) o fabbricazione di filamenti fusi (FFF), è un metodo per depositare strati impilati di materiale forzando un liquido viscoso o materiale fuso attraverso un ugello. È possibile estrudere un filamento di polimero termoplastico, come acido polilattico (PLA) o termoindurenti, sospensioni cellulari e fotopolimeri a polimerizzazione UV.

Invece di goccioline, come con i metodi DoD, la stampante crea un flusso continuo che viene posizionato sul substrato. L’estrusione a pressione di liquidi, paste o dispersioni viene utilizzata nella biostampa assistita da pressione. Le biostampanti per estrusione possono creare parti utilizzando materiali con un’ampia gamma di viscosità impiegando metodi a pistone, pneumatici o a vite. I metodi di estrusione sono generalmente più lenti, ma possono fornire alti tassi di sopravvivenza cellulare, rendendoli eccellenti per l’ingegneria dei tessuti duri.

I sistemi di bioprinting per estrusione possono contenere più testine di stampa per estrudere materiali diversi, come scaffold e materiali cellulari (ad esempio, l’MHDS o Multi Head Deposition System sviluppato dai ricercatori della Postech University). Il team del Dr. Atala presso il Wake Forest Institute for Regenerative Medicine (WFIRM) ha presentato nel 2016 una stampante per organi tissutali multi-testa integrata (ITOP), progettata per produrre costrutti di tessuti stabili e su scala umana di qualsiasi forma.

Altri metodi di bioprinting

L’elettrospinning è una versatile tecnologia di stampa 3D che prevede l’espulsione di una soluzione di polimero viscoelastico caricata elettricamente su un collettore per creare fibre. Un forte campo elettrico generato da un’alta tensione tra l’uscita di una soluzione polimerica e il collettore guida il percorso di viaggio della soluzione polimerica carica. Questo metodo può creare fibre ultrafini con dimensioni che vanno da pochi micrometri a pochi nanometri.

Il bioprinting magnetico 3D è una tecnica per assemblare cellule in strutture o colture 3D utilizzando nanoparticelle magnetiche biocompatibili. Nano3D (n3D) Biosciences (ora di proprietà di Greiner-One Bio) ha sviluppato un nanoshuttle, che è un assemblaggio di nanoparticelle magnetiche composto da oro, ossido di ferro magnetico e poli-L-lisina che aiuta l’adesione alla membrana cellulare attraverso interazioni elettrostatiche. Le forze magnetiche esterne possono essere utilizzate per disporre le cellule contrassegnate con il nanoshuttle magnetico in particolari modelli 3D che imitano la struttura e la funzione dei tessuti. Rispetto alle tecniche di estrusione, l’approccio magnetico è sostanzialmente più veloce.

Il Prof. Koich Nakayama della Saga University ha ideato la tecnica Kenzan e la Biomedical KK, con sede in Giappone, ha ottenuto i diritti esclusivi per utilizzarla sulla sua biostampante Regenova. In questo approccio vengono coltivati ​​sferoidi, o aggregati cellulari, con diverse decine di migliaia di cellule per sferoide. Quindi, senza alcun materiale di supporto aggiuntivo, gli sferoidi vengono inseriti direttamente in sottili matrici di aghi e lasciati combinare con sferoidi adiacenti per formare una struttura collegata. Gli sferoidi cellulari possono essere posizionati in qualsiasi configurazione tridimensionale desiderata con un corretto allineamento. Infine, la crescita di sferoidi cellulari collegati in un bioreattore incoraggia l’auto-organizzazione cellulare e produce un tessuto 3D con la funzione e la qualità appropriate.

Applicazioni del bioprinting

La perdita o il fallimento di organi e tessuti è un problema difficile e costoso nel settore sanitario. Ciò significa anche che il potenziale del bioprinting di generare organi funzionali per l’impianto è l’unica opportunità più importante per il futuro a lungo termine della produzione additiva. In effetti, gli analisti raramente prendono in considerazione la tecnologia di bioprinting quando proiettano i ricavi futuri dall’AM, nonostante abbia il potenziale per coprire fino al 2% dell’intera attività manifatturiera entro i prossimi due decenni. Questo anche perché le applicazioni di produzione di organi commerciali sono ben oltre il regno di qualsiasi analisi pratica. Tuttavia, le applicazioni di bioprinting nella rigenerazione dei tessuti che non ruotano attorno a organi complessi completamente funzionali hanno un mercato considerevole.

La scarsità di organi in tutto il mondo, d’altra parte, è una motivazione significativa per la ricerca sull’ingegneria tissutale, in particolare la progettazione di un microambiente cellulare-impalcatura per stimolare la rigenerazione di molti tipi di tessuto, tra cui pelle, cartilagine, ossa, tendini e tessuto cardiaco.

Pelle e ossa

Nell’ingegneria tissutale la bioprinting consente la creazione di costrutti con maggiore risoluzione e complessità di quanto sia possibile con gli approcci di laboratorio tradizionali. Il bioprinting è diventato un metodo comune per fabbricare impalcature di ingegneria tissutale della cartilagine da un’ampia gamma di materiali, tra cui ceramica e nanomateriali.

Cartilagine

La cartilagine è un tessuto connettivo flessibile che è fondamentale per l’elasticità e il movimento fluido nelle attività umane quotidiane. È composto da cellule chiamate condrociti, circondate da una matrice gelatinosa composta da proteine ​​e carboidrati. A differenza dell’osso, la cartilagine non ha un apporto di sangue e quindi non ha la capacità di ripararsi rapidamente. Questa caratteristica lo ha reso un candidato ideale per le prime applicazioni sperimentali di bioprinting poiché non richiederebbe la capillarizzazione complessa.

Nel processo per indurre la condrogenesi (come si forma la cartilagine), la rigenerazione della cartilagine nelle procedure di stampa di tessuti/organi include fonti cellulari appropriate (cellule staminali mesenchimali o MSC, cellule staminali stromali di origine adiposa o ASC e condrociti), idrogel (collagene di tipo I e II , gelatina, acido ialuronico, alginato) e fattori di crescita (GF).

La ricostruzione o la rigenerazione del tessuto neocartilagineo mediante tecniche di bioprinting 3D ha ricevuto molta attenzione, ma finora non ha prodotto applicazioni commerciali praticabili impiantabili nell’uomo. La bioprinting della cartilagine nei dischi intervertebrali, nei menischi e nelle ginocchia rimane in gran parte confinata alla ricerca accademica senza applicazioni commerciali significative attualmente in linea per essere approvate per l’uso nell’uomo. Un certo successo è stato ottenuto in termini di implementazione di scaffold per supportare la ricrescita della cartilagine tracheale utilizzando strutture stampate in 3D polimeriche (PCL).

Pelle

La pelle, l’organo più esteso del corpo, presenta una struttura complessa costituita da tre strati predominanti (epidermide, derma e ipoderma). L’ingegneria dell’architettura della pelle multistrato che si conforma alla struttura della pelle nativa è un obiettivo difficile, se non irraggiungibile, da raggiungere con gli attuali metodi di ingegneria dei tessuti, così come il ripristino di tutte le funzioni della pelle nativa.

Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nel campo del bioprinting cutaneo, che hanno portato allo sviluppo di modelli di tessuto cutaneo più complessi e sofisticati. I ricercatori hanno biostampato con successo costrutti di pelle multistrato che imitano la struttura e la composizione della pelle nativa, completa di epidermide, derma e strati sottocutanei. Questo ha aperto nuove strade per studiare le malattie della pelle e testare nuovi trattamenti. Inoltre, la biostampa cutanea è stata utilizzata anche nello sviluppo di sostituti della pelle per le vittime di ustioni e altri pazienti con lesioni cutanee. Questi costrutti di pelle biostampata hanno mostrato risultati promettenti nei primi studi clinici, offrendo una potenziale soluzione per la carenza di pelle donatrice e le preoccupazioni etiche associate. Complessivamente,

Sebbene esistano numerosi sostituti della pelle, non ci sono state soluzioni che ricapitolino i ruoli chimici, meccanici e biologici che esistono all’interno della pelle nativa. Proprio di recente, un team di ricercatori dell’Università di Birmingham ha utilizzato un metodo chiamato produzione additiva a strati sospesi (SLAM) per produrre un impianto continuo a tre strati, che ricorda da vicino la pelle umana. Attraverso un attento controllo della composizione del bioinchiostro, si sono formati gradienti (chimici e cellulari) in tutto il costrutto stampato. La coltura del modello ha dimostrato che in 21 giorni i componenti cellulari hanno svolto un ruolo chiave nel rimodellamento della matrice di supporto in architetture paragonabili a quelle della pelle sana. I ricercatori ritengono che questi impianti possano facilitare la guarigione, a partire dalla fascia, fino alla superficie della pelle, un meccanismo recentemente dimostrato essere fondamentale nelle ferite profonde.

Ossa

Poiché la natura dei tessuti duri è semplice e formata principalmente da materiali inorganici, la rigenerazione ossea, insieme alla rigenerazione della cartilagine, è il campo più consolidato che utilizza la tecnologia di stampa. Molti processi di produzione sono stati utilizzati per produrre una gamma di biomateriali per la costruzione di scaffold ossei; tuttavia, il bioprinting 3D consente un controllo più preciso delle caratteristiche strutturali e meccaniche degli scaffold artificiali rispetto ad altre tecnologie. Nella clinica sono necessari tessuti duri innovativi, stabili e riassorbibili e materiali per la riparazione di organi generati con la tecnologia di bioprinting 3D.

Ceramiche come il fosfato tricalcico (TCP) e l’idrossiapatite (HA) sono comunemente utilizzate nell’ingegneria del tessuto osseo. Sono materiali biocompatibili simili nella composizione all’osso naturale. Nella stampa 3D, l’idrossiapatite viene solitamente combinata con un agente legante monomerico e quindi polimerizzata strato dopo strato per costruire la forma finale dell’impianto. Questo processo consente la creazione di impianti adattati alle esigenze specifiche di ciascun paziente, fornendo una migliore vestibilità e un maggiore comfort rispetto ai tradizionali metodi di produzione degli impianti.

Vale la pena notare, tuttavia, che la stampa 3D di idrossiapatite per impianti ossei è ancora una tecnologia relativamente nuova e il suo utilizzo nei casi reali è tutt’altro che standardizzato. Tuttavia, i potenziali vantaggi della stampa 3D in questo settore sono significativi e si prevede che la tecnologia svolga un ruolo sempre più importante nello sviluppo di impianti ossei personalizzati in futuro. Le possibili applicazioni includono cunei per osteotomia tibiale, gabbie intervertebrali, impianti cranici, sostituti ossei generali, impianti spinali generali e impianti ortopedici generali.

Test cosmetici

La sperimentazione di prodotti farmaceutici e cosmetici è un’altra area in cui le pelli modificate sono disperatamente necessarie, soprattutto perché la sperimentazione sugli animali non è più consentita o sta per essere messa al bando in molti paesi. Data questa crescente esigenza, la biostampa 3D è un potenziale metodo per produrre sostituti cellulari biomimetici della pelle in modo rapido e affidabile, soddisfacendo sia le esigenze cliniche che quelle industriali.

Le aziende cosmetiche sono estremamente interessate alle odierne applicazioni avanzate di stampa 3D e bioprinting, come i tessuti stampati in 3D e persino i follicoli piliferi, soprattutto in Europa, dove i test sugli animali per i cosmetici sono stati banditi nel 2013.

Il gigante della cosmetica L’Oréal e Poietis, una startup biotecnologica francese, hanno firmato una partnership di ricerca esclusiva per la biostampa dei follicoli in grado di far germogliare i capelli. Questo non solo può portare a test sui prodotti per capelli più efficaci, ma potrebbe anche aumentare la nostra comprensione di come funzionano i capelli, aprendo la strada a potenziali rimedi biologici per la caduta dei capelli negli adulti.

L’anno scorso il test di fototossicità EpiDerm è stato accettato come parte della linea guida per il test n. 498 Fototossicità in vitro: metodo di test sulla fototossicità dell’epidermide umana ricostruita dall’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE). EpiDerm è prodotto da MatTek Life Sciences, una sussidiaria di CELLINK. Questo sforzo è in linea con gli obiettivi del Gruppo di ridurre ed eventualmente sostituire i test sugli animali sviluppando tecnologie e metodi che siano più rilevanti per l’uomo e forniscano una previsione più accurata delle risposte cliniche umane. Questa è stata la quarta validazione delle linee guida per i test dell’OCSE per i modelli di tessuto in vitro di MatTek dopo le validazioni per Irritazione cutanea (OCSE TG 439), Corrosione cutanea (OCSE TG 431) e Irritazione oculare (OCSE TG 492).

Agricoltura a livello cellulare

L’agricoltura cellulare, un’area di studio interdisciplinare all’incrocio tra salute e agricoltura, potrebbe trarre notevoli vantaggi dalla capacità della stampa 3D di aggiungere forme complesse a carni e latticini coltivati ​​in laboratorio, nonostante il suo attuale nesso con la tecnologia di bioprinting 3D. Le aziende di agricoltura cellulare intendono avanzare nell’ingegneria dei tessuti, nelle scienze dei materiali, nella bioingegneria e nella biologia sintetica per creare nuovi modi per produrre prodotti agricoli esistenti come latte, carne e profumi (e persino il corno di rinoceronte) da cellule e microbi.

L’hamburger coltivato del professor Mark Post del 2013, che ha stabilito una prova di concetto per la carne coltivata, è il primo esempio di prodotto di agricoltura cellulare. Il costo per generare un prodotto commestibile delle dimensioni di un hamburger coltivato in laboratorio è in costante calo, da diverse centinaia di migliaia di dollari a poche centinaia e anche meno, tuttavia la produttività rimane bassa e lungi dall’essere in grado di soddisfare la domanda del mercato di massa.

Dozzine di aziende in tutto il mondo stanno lavorando per introdurre a un certo livello prodotti sostitutivi della carne (o alt-meat) dell’agricoltura cellulare. Non tutti producono questi alimenti utilizzando la tecnologia di stampa 3D e non tutti utilizzano cellule reali (in alcuni casi le proteine ​​sono ottenute da fonti vegetali). Quelli che usano la stampa 3D hanno sede principalmente in Israele: Aleph Farms, Savor Eat, Meat-Tech e Redfine Meat stanno tutti implementando processi e flussi di lavoro di estrusione legati alla biostampa per ridurre i costi e accelerare la produzione dei loro prodotti alternativi alla carne.

*Questo articolo è stato originariamente pubblicato su Medical/Bioprinting AM Focus 2022 di 3dpbm . È stato aggiornato per riflettere gli ultimi sviluppi.

**Alcuni dei contenuti generici dell’articolo sono stati ottimizzati utilizzando ChatGPT AI

***L’autore di questo articolo possiede azioni in alcune delle società citate